Xây dựng quy trình phát hiện nấm Candida spp. bằng phương pháp multiplex PCR

Chỉ số đề mục

76

Lĩnh vực nghiên cứu

Kỹ thuật và thiết bị y học

Dạng tài liệu

Tác giả

Nguyễn Tú Anh⁽²⁾, Lê Thị Thanh Thảo, Phan Cảnh Trình, Nguyễn Minh Thái⁽¹⁾, Nguyễn Thị Ngọc Yến, Tôn Hoàng Diệu, Trần Quốc Việt, Nguyễn Hiếu

Nhan đề

Xây dựng quy trình phát hiện nấm Candida spp. bằng phương pháp multiplex PCR

Nhan đề tiếng anh

Building process for detecting Candida spp. by multiplex PCR methods

Nguồn trích

Tạp chí Y học Việt Nam (Tổng hội Y học Việt Nam)

Năm xuất bản

2023

Số

1

Trang

226-231

ISSN

1859-1868

Từ khóa

Nấm, Multiplex PCR, Quy trình

Từ khóa tiếng anh

Candida, Multiplex PCR, Process

Tóm tắt

Nghiên cứu này thực hiện với 2 mục tiêu: (1) Xác định và tối ưu hóa điều kiện multiplex PCR phát hiện 04 nấm C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis. (2) Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 04 loài nấm C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis bằng phương pháp multiplex PCR. Phương pháp: Các mẫu Candida spp. được thu nhận tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM, Bệnh viện Lê Văn Thịnh và Bệnh viện Quân Y 175 từ tháng 10/2020 đến tháng 5/2021. Vi nấm được phát hiện bằng các phương pháp: (1) thử nghiệm tạo ống mầm, (2) phân lập trên môi trường CHROMagar Candida, (3) tối ưu hóa quy trình phát hiện Candida spp. bằng kỹ thuật Multiplex PCR và sử dụng quy trình tối ưu trong phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh phẩm và (4) giải trình tự 5 sản phẩm khuếch đại để kiểm tra tính đặc hiệu. Sau đó, tiến hành so sánh và biện luận kết quả phát hiện Candida spp. bằng 3 phương pháp: thử nghiệm tạo ống mầm, CHROMagar Candida và Multiplex PCR. Kết quả: 40 mẫu bệnh phẩm được phát hiện bằng vào 3 phương pháp: thử nghiệm tạo ống mầm: phát hiện 13 loài C. albicans và 27 loài non-albicans Candida, nuôi cấy môi trường CHROMagar Candida: phát hiện 18 loài C. albicans, 5 loài C. tropicalis, 3 loài C. glabrata và 14 loài non-albicans Candida. Với multiplex PCR: phát hiện 18 loài C. albicans, 7 loài C. tropicalis, 8 loài C. glabrata, 6 loài C. parapsilosis và 1 loài không xác định được. Các thành phần Multiplex PCR phát hiện 4 loài Candida được tối ưu trong 1 ống eppendorf: dung dịch đệm PCR 10 X 2,2 μl; MgSO4 25 mM 0,6 μl; Taq DNA polymerase 5 UI/μl 0,3 μl; dNTP 10 mM 0,5 μl, mồi Falb 5 pmol 0,3 μl; Ralb 5 pmol 0,5 μl; Ftro 5 pmol 0,3 μl; Fpara 5 pmol 0,6 μl; Rpara 5 pmol 0,6 μl; Fgla 5 pmol 0,3 μl; Rgla 5 pmol 0,3 μl; dịch chiết DNA 1 μl; nước khử khoáng vừa đủ 25 μl. Chương trình PCR được tối ưu: giai đoạn biến tính ban đầu 95 oC 5 phút (1 chu kỳ), giai đoạn 2 (40 chu kỳ): biến tính 95 oC 30 giây, gắn mồi 59 oC 30 giây, kéo dài mồi 72 oC 30 giây; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72 oC 8 phút (1 chu kỳ).

Tóm tắt tiếng anh

This study was carried out with two objectives: (1) Determine and optimize multiplex PCR conditions to detect 04 fungi C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, and C. parapsilosis. (2) Develop a process to simultaneously detect 04 species of C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, and C. parapsilosis by multiplex PCR method. Method: Candida spp. was admitted to the University of Medicine and Pharmacy Hospital in Ho Chi Minh City. Ho Chi Minh City, Le Van Thinh Hospital, and Military Hospital 175 from October 2020 to May 2021. The fungus was detected by the following methods: (1) germplasm test, (2) isolation on CHROMagar Candida medium, (3) optimization of the Candida spp detection procedure by Multiplex PCR technique and using the optimal procedure in detecting Candida spp. from patient samples and (4) sequenced 5 amplification products to check for specificity. Then, compare and interpret the results of detecting Candida spp. by 3 methods: germ tube test, CHROMagar Candida, and Multiplex PCR. Results: 40 patient samples were detected by 3 methods: Germ tube testing: detecting 13 species of C. albicans and 27 species of C. non-albicans, culture of CHROMagar Candida: detecting 18 species of C. albicans, 5 species C. tropicalis, 3 species of C. glabrata and 14 species of C. non-albicans. With multiplex PCR: detected 18 species of C. albicans, 7 species of C. tropicalis, 8 species of C. glabrata, 6 species of C. parapsilosis and 1 unidentified species. Multiplex PCR components for optimal detection of 4 Candida species in 1 effendop tube: PCR buffer 10 X 2.2 μl; MgSO4 25 mM 0.6 μl; Taq DNA polymerase 5 UI/μl 0.3 μl; dNTP 10 mM 0.5 μl; primer Falb 5 pmol 0.3 μl; Ralb 5 pmol 0.5 μl; Ftro 5 pmol 0.3 μl; Fpara 5 pmol 0.6 μl; Rpara 5 pmol 0.6 μl; Fgla 5 pmol 0.3 μl, Rgla 5 pmol 0.3 μl; DNA extract 1 μl; enough demineralized water 25 μl. Optimized PCR program: initial denaturation period 95oC 5 min (1 cycle), stage 2 (40 cycles): denaturation 95oC 30 s, primer 59 oC 30 s, primer extension 72oC 30 seconds; final elongation n period 72°C 8 min (1 cycle).

Kí hiệu kho

TTKHCNQG, CVv 46

File toàn văn

Xem toàn văn