HỆ THỐNG THÔNG TIN QUỐC GIA VỀ KHOA HỌC, CÔNG NGHỆ VÀ ĐỔI MỚI SÁNG TẠO
Lọc theo danh mục
liên kết website
Lượt truy cập
Lượt truy cập :
29,967,419
- Công bố khoa học và công nghệ Việt Nam
76
Kỹ thuật và thiết bị y học
BB
Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Hưng Thịnh, Nguyễn Đoàn Huỳnh Anh Phúc, Nguyễn Hữu Ngọc Tuấn(1)
Xây dựng bộ công cụ chẩn đoán biến thể đa hình đơn nucleotide rs738409 trên gen PNPLA3 bằng kỹ thuật realtime PCR sử dụng chất phát huỳnh quang SYBR
Constructing a real-time PCR process using SYBR fluorescent reporter to diagnose the single nucleotide polymorphism variant rs738409 in the PNPLA3 gene
Tạp chí Y học Việt Nam (Tổng hội Y học Việt Nam)
2024
1B
341-346
1859-1868
Xây dựng bộ công cụ chẩn đoán biến thể đa hình đơn nucleotit rs738409 trên gen PNPLA3 bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang SYBR. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xây dựng quy trình real-time PCR bằng cặp đoạn mồi tự thiết kế để chẩn đoán biến thể rs738409 trên gen PNPLA3 bằng công cụ primer-BLAST (NCBI, Hoa Kỳ). Đánh giá độ đặc hiệu, tối ưu hóa nồng độ của đoạn mồi đã thiết kế. Tạo các dòng DNA plasmid mang lần lượt biến thể C và biến thể G của rs738409 bằng phương pháp TA cloning. Thẩm định khả năng xác định kiểu gen của biến thể rs738409 trên gen PNPLA3 thông qua phản ứng real-time PCR với bộ DNA plasmid chứng giả lập các kiểu gen biến thể quan tâm bằng bộ sinh phẩm SensiFAST SYBR (Bioline). Áp dụng quy trình lên 147 mẫu đã được khẳng định kết quả kiểu gen biến thể bằng giải trình tự Sanger để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác thực của quy trình đã xây dựng. Kết quả: Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật real-time PCR SYBR chẩn đoán biến thể rs738409 trên gen PNPLA3. Các đoạn mồi đặc hiệu alen đạt độ đặc hiệu khi kiểm tra bằng điện di mao quản và phân tích đường cong nóng chảy. Nồng độ tối ưu của các đoạn mồi là 250 nM, với CV% giá trị Ct giữa các lần lặp lại phản ứng đều nhỏ hơn 11% và giá trị Ct trung bình trong khoảng 25-30. Xác định được giá trị |ΔCt| bằng 3 là khoảng phân biệt các kiểu gen của biến thể (CV% nhỏ hơn 11%). Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác thực của kỹ thuật lần lượt là 98,6%, 100% và 99,3%. Kết luận: Đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật real-time PCR SYBR để xác định biến thể rs738409 trên gen PNPLA3.
Establishing a molecular procedure to identify the variant rs738409 on the PNPLA3 gene using the real-time PCR technique with SYBR fluorescent reporter. Methods: Constructing a realtime PCR procedure to diagnose the rs738409 polymorphism on the PNPLA3 gene with self-designed primer pairs by using the primer-BLAST tool from NCBI (USA). Evaluating the specificity and optimizing the concentration of the designed primers. Generating DNA plasmid lines containing the C and G allele of rs738409 using the TA cloning method. Validating the ability to determine the genotype of the variant through real-time PCR reactions with a set of plasmid DNA controls using SensiMix™SYBR®Low-ROX Kit reagents (Bioline). Applying the procedure to 147 samples confirmed for genotype variants by Sanger sequencing to evaluate the sensitivity, specificity, and accuracy of the developed procedure. Results: Successfully constructed a technical procedure for real-time PCR SYBR to diagnose the rs738409 polymorphism on the PNPLA3 gene. The specific primer sequences achieve specificity when tested by capillary electrophoresis and melt curve analysis. The optimal primer concentration is 250 nM, with a CV% of Ct values between replicate reactions less than 11% and the average Ct value ranging from 25 to 30. The determined value of |ΔCt| is 3, which distinguishes the genotype variants (CV% less than 11%). The sensitivity, specificity, and accuracy of the technique are 98.6%, 100%, and 99.3%, respectively. Conclusion: A technical procedure for real-time PCR SYBR was successfully developed to determine the rs738409 variant on the PNPLA3 gene.
TTKHCNQG, CVv 46
Xem toàn văn