Tạo dòng Escherichia coli biểu hiện ribonuclease H tái tổ hợp từ Thermus thermophilus

Chỉ số đề mục

Lĩnh vực nghiên cứu

Công nghệ liên quan đến xác định chức năng của ADN, protein, enzym

Dạng tài liệu

Tác giả

Nguyễn Thị Linh Giang, Phạm Nguyên Hoàng, Hà Vi, Vũ Thanh Thảo⁽¹⁾, Trần Cát Đông

Nhan đề

Tạo dòng Escherichia coli biểu hiện ribonuclease H tái tổ hợp từ Thermus thermophilus

Nhan đề tiếng anh

Nguồn trích

Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh

Năm xuất bản

2021

Số

2-CD5

Trang

56-63

ISSN

1859-1779

Từ khóa

Ribonuclease H, Thermus thermophilus, Tạo dòng, Tái tổ hợp, Escherichia coli

Từ khóa tiếng anh

Tóm tắt

Ribonuclease H thủy phân đặc hiệu liên kết phosphodiester của phân tử lai RNA-DNA. Thermus thermophilus RNase H được biểu hiện uá mức trong Escherichia coli dưới dạng protein tái tổ hợp sẽ tạo ra nguồn cung cấp enzyme RNase H thể hiện được hoạt tính ở nhiệt độ cao và ít bị biến tính hay bất hoạt trong các điều kiện cực đoan. Mục tiêu: Tạo dòng Escherichia coli tái tổ hợp biểu hiện Ribonuclease H có nguồn gốc từ Thermus thermophilus. Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu: Plasmid pET.RiboH được cấu trúc từ plasmid pET28b(+) và đoạn gen RiboH từ Thermus thermophilus và biến nạp plasmid vào E. coli. Ribonuclease H được thu nhận và tinh chế bằng sắc kí trao đổi cation ua cột SP-sepharose. Kết quả: Tạo dòng thành công chủng E. coli BL21(DE3) chứa plasmid pET.RiboH được cảm ứng biểu hiện Ribonuclease H bằng IPTG. Lượng Ribonuclease H thu nhận được sau tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation là 33,8 mg/L dịch nuôi cấy. Hoạt tính thủy phân liên kết phosphodiester của RNase H tái tổ hợp được kiểm tra bằng cách ủ với phân tử lai RNA-DNA và kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose. Kết luận: Chủng E. coli mang plasmid tái tổ hợp có khả năng biểu hiện Ribonuclease H thể hiện được hoạt tính thủy phân đặc hiệu liên kết phosphodiester của phân tử lai RNA-DNA.

Tóm tắt tiếng anh

Kí hiệu kho

TTKHCNQG, CVv 395

File toàn văn

Xem toàn văn

Tài liệu tham khảo

[1] Hirano N, Haruki M, Morikawa M, et al (1998), Stabilization of ribonuclease HI f-rom Thermus thermophilus HB8 by the spontaneous formation of an intramolecular disulfide bond.,Biochemistry, 37(36):12640-12648.
[2] Roche (2016), Ribonuclease H (RNase H).,URL: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Roche/Bulletin/1/10786357001bul.pdf (access on 15/10/2020)
[3] Potenza N, De Colibus L, (2005), Gel-based assay for ribonuclease H activity toward unlabeled poly(A)-poly(dT).,Analitycal Biochemistry, 337(1):167-169.
[4] Cummins P, Dowling O, O'Connor B (2011), Ion-exchange chromatography: basic principles and application to the partial purification of soluble mammalian prolyl oligopeptidase.,Methods in Molecular Biology (Clifton N.J.), 681:215-228
[5] Becerra SP, Clore GM, Gronenborn AM, et al (1990), Purification and c-haracterization of the RNase H domain of HIV-1 reverse transcriptase expressed in recombinant Escherichia coli.,FEBS Letter, 270(1-2):76-80
[6] Itaya M, McKelvin D, Chatterjie SK, et al (1991), Se-lective cloning of genes encoding RNase H f-rom Salmonella typhimurium, Sacc-haromyces cerevisiae and Escherichia coli RNH mutant.,Molecular and General Genetics: MGG, 227(3):438-445
[7] Kanaya S, Itaya M (1992), Expression, purification, and c-haracterization of a recombinant ribonuclease H f-rom Thermus thermophilus HB8.,The Journal of Biological Chemistry, 267(14):10184- 10192
[8] Haruki M, Hayashi K, Kochi T, et al (1998), Gene cloning and c-haracterization of recombinant RNase HII f-rom a hyperthermophilic archaeon.,Journal of Bacteriology, 180(23):6207-6214.
[9] Gupta SK, Shukla P (2016), Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications.,Critical Reviews in Biotechnology, 36(6):1089-1098.
[10] Cava F, Hidalgo A, Berenguer J (2009), Thermus thermophilus as biological model.,Extremophiles: Life Under Extreme Conditions, 13(2):213-231.
[11] Pantazaki A, Pritsa A, Kyriakidis D (2002), Biotechnologically relevant enzymes f-rom Thermus thermophilus.,Applied Microbiology and Biotechnology, 58(1):1-12
[12] Lomonosova E, Zlotnick A, Tavis JE (2017), Synergistic Interactions between hepatitis B virus RNase H antagonists and other inhibitors.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 61(3):e02441-16.
[13] Tavis JE, Cheng X, Hu Y, et al (2013), The hepatitis B virus ribonuclease H is sensitive to inhibitors of the human immunodeficiency virus ribonuclease H and integrase enzymes.,PLoS Pathogens, 9(1):e1003125
[14] Kankanala J, Kirby KA, Huber AD, et al (2017), Design, synthesis and biological evaluations of N-Hydroxy thienopyrimidine-2,4- diones as inhibitors of HIV reverse transcriptase-associated RNase H.,European Journal of Medicinal Chemistry, 141:149-161.
[15] Gubler U (1987), Second-strand cDNA synthesis: mRNA fragments as primers.,Methods in Enzymology, 152:330-335.
[16] Dobosy J, Rose S, Beltz K, et al (2011), RNase H-dependent PCR (rhPCR): Improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blocked cleavable primers.,BMC Biotechnology, 11:80
[17] Donis-Keller H (1979), Site specific enzymatic cleavage of RNA.,Nucleic Acids Research, 7(1):179-192.
[18] Hollis T, Shaban NM (2011), Structure and function of RNase H enzymes. In: Nicholson AW (eds).,Ribonucleases, pp.299-317. Springer, Berlin, Heidelberg.